OBTENCIÓN DEL ADN RECOMBINANTE..

Comprende las siguientes etapas: obtención del inserto de ADN que interese, mediante la utilización de las enzimas de restricción; unión de este a un ADN vector; y la transformación en una célula procariótica o eucariótica.

El descubrimiento de las enzimas llamadas endonucleasas de restricción, capaces de reconocer y cortar el ADN en puntos determinados, fue la pista que orientó hacia el momento en que se podían recombinar los genes en el laboratorio.

Si se quieren unir dos ADNs, cada uno de los cuales procede de una especie diferente podemos utilizar dichas enzimas como herramientas. Cada ADN se trata con una endonucleasa de restricción que origina en este caso un corte escalonado en las dos hebras dobles de ADN. Los extremos escalonados del ADN1 y el ADN2 son complementarios, con lo cual, una condición que tiene que tener los dos ADNs que se quiere unir es que tengan un pequeño fragmento igualen sus secuencias. Los dos DNAs así cortados se mezclan, se calientan y sé enfrían suavemente. Sus extremos cohesivos se aparearán dando lugar a un nuevo ADN recombinado, con uniones no covalentes. Las uniones covalentes se consiguen añadiendo ADN ligasa y una fuente energética para formar los enlaces (forma A).

Otra enzima clave para unir ADNs es la transferencia terminal, que puede adicionar muchos residuos de desoxirribonucleótidos sucesivos al extremo 3´de las hebras del ADN. De este modo pueden construirse colas de poli G ( nucleótico de guanina) en los extremos 3´ de las dos hebras de ADN dúplex y colas de poli C ( nucleótico de citosina) en los extremos del otro ADN. Como estas colas son complementarias, permitirán que los dos ADNs se unan por complementariedad. Posteriormente, se forman los enlaces covalentes por el ADN ligasa (forma B).

El ADN vector es el vehículo de clonaje, ya que transporta el inserto de ADN a una molécula hospedadora, donde pueden ser replicado. Los vectores o transportadores más utilizados son los plásmidos y el ADN del fago lambda. plásmidos Estos son pequeños ADNs de cadena doble y circular, que se encuentran en el citoplasma de la mayoría de las bactérias. Cada plásmido contiene varios genes que se replican, transcriben y traducen independientemente de los genes del cromóforo bacteriano, pero simultáneamente en el tiempo.

Se pueden unir genes extraños a los plásmidos con mucha facilidad, y después ser transportados como pasajeros al interior de las células de E. coli.

ADN del fago lambda.
Es otro vector que puede ser utilizado para introducir genes en bacterias. Cuando el ADN recombinado del fago lambda, con su gen pasajero, se mezcla con la cubierta del virus lambda, se producen partículas fágicas infecciosas, si el tamaño del ADN recombinado no es muy distinto del ADN natural del virus lambda.

Los procesos de clonaje y de aislamiento de estos fragmentos se inician con la construcción de una biblioteca de ADN o un banco de ADN. Éstas están formadas por todas las moléculas de plásmidos o fagos recombinantes originados al unir un ADN a un vector. Las bibliotecas deben cumplir la característica de poder introducirse en células donde cada recombinante pueda aplicarse in vivo.