El 1884, el microbiòleg francès Charles Chamberland inventà un filtre (conegut actualment com a filtre Chamberland o filtre Chamberland-Pasteur) que té porus de mida inferior a la d'un bacteri. Així doncs, podia fer passar pel filtre una solució amb bacteris i eliminar-los completament de la solució. El biòleg rus Dimitri Ivanovski utilitzà aquest filtre per a estudiar el que actualment es coneix com a virus del mosaic del tabac. Els seus experiments demostraren que els extractes de fulles mòltes de plantes de tabac infectades encara eren infecciosos després de filtrar-los. Ivanovski suggerí que la infecció podria ser causada per una toxina produïda pels bacteris, però no perseguí la idea. Aleshores, es creia que tots els agents infecciosos podien ser retinguts per filtres i cultivats en un medi amb nutrients - això formava part de la teoria germinal de les malalties. El 1899, el microbiòleg neerlandès Martinus Beijerinck repetí els experiments i quedà convençut que es tractava d'una nova forma d'agent infecciós. Observà que l'agent només es multiplicava dins de cèl·lules en divisió, però com que els seus experiments no mostraven que estigués compost de partícules, l'anomenà contagium vivum fluidum ("germen vivent soluble") i reintroduí el terme "virus". Beijerinck mantenia que els virus eren de naturalesa líquida, una teoria més tard descartada per Wendell Stanley, que demostrà que eren particulats. El mateix any, el 1899, Friedrich Loeffler i Frosch passaren l'agent de la febre aftosa (l'aftovirus) per un filtre similar i descartaren la possibilitat d'una toxina a causa de l'alta dilució; arribaren a la conclusió que l'agent es podia replicar.
A principis del segle XX, el bacteriòleg anglès Frederick Twort descobrí els virus que infecten bacteris, que actualment es denominen bacteriòfags, i el microbiòleg francocanadenc Félix d'Herelle descrigué virus que, quan se'ls afegia a bacteris cultivats en agar, produïen zones de bacteris morts. Diluí amb precisió una suspensió d'aquests virus i descobrí que les dilucions més altes, en lloc de matar tots els bacteris, formaven zones individuals d'organismes morts. Comptant aquestes zones, i multiplicant-les pel factor de dilució, D'Herelle pogué calcular el nombre de virus de la suspensió.
A finals del segle XIX, els virus eren definits en termes de la seva infectivitat, filtrabilitat, i la seva necessitat d'hostes vivents. Els virus només havien estat cultivats en plantes i animals. El 1906, Harrison inventà un mètode per a cultivar teixits en limfa, i, el 1913, E. Steinhardt, C. Israeli i R. A. Lambert utilitzaren aquest mètode per a cultivar virus de Vaccinia en fragments de teixit corneal de conill porquí. El 1928, H. B. Maitland i M. C. Maitland cultivaren virus Vaccinia en suspensions de ronyons picats de gallina. El seu mètode no fou adoptat àmpliament fins el 1950, quan es començà a cultivar poliovirus a gran escala per la producció de vacunes.
Un altre avenç es produí el 1931, quan el patòleg estatunidenc Ernest William Goodpasture cultivà el virus de la grip i diversos altres virus en ous fertilitzats de gallina. El 1949, John F. Enders, Thomas Weller i Frederick Robbins cultivaren virus de la poliomielitis en cèl·lules cultivades d'embrions humans, sent el primer cop que es cultivava un virus sense utilitzar teixits animals sòlids o ous. Aquest treball permeté a Jonas Salk crear una vacuna efectiva contra la poliomielitis.
Amb la invenció de la microscòpia electrònica el 1931 per part dels enginyers alemanys Ernst Ruska i Max Knoll, s'obtingueren les primeres imatges de virus. El 1935, el bioquímic i viròleg estatunidenc Wendell Stanley examinà el virus del mosaic del tabac i descobrí que estava compost principalment de proteïnes. Poc temps després, el virus fou separat en les seves parts de proteïnes i d'ARN. El virus del mosaic del tabac fou un dels primers en ser cristal·litzats, i per tant, dels primers l'estructura de la qual pogué ser observada en detall. Les primeres imatges per difracció de raigs X del virus cristal·litzat foren obtingudes per Bernal i Fankuchen el 1941. Basant-se en les seves imatges, Rosalind Franklin descrobrí l'estructura completa del virus el 1955. El mateix any, Heinz Fraenkel-Conrat i Robley Williams demostraren que l'ARN purificat del virus del mosaic del tabac i les seves proteïnes d'embolcall poden assemblar-se per si sols, formant virus funcionals, suggerint que aquest mecanisme senzill era probablement com s'assemblaven els virus dins les cèl·lules hostes.
La segona meitat del segle XX fou l'edat daurada del descobriment de virus, i la majoria de les 2.000 espècies reconegudes de virus animals, vegetals i bacterians foren descobertes durant aquests anys. El 1957, es descobriren l'arterivirus equí i la causa de la diarrea vírica bovina (un pestivirus). El 1963, el virus de l'hepatitis B fou descobert per Baruch Blumberg, i el 1965, Howard Temin descrigué el primer retrovirus. La transcriptasa inversa, l'enzim clau que utilitzen els retrovirus per a traduir el seu ARN en ADN, fou descrita originalment el 1970, de manera independent per Howard Temin i David Baltimore. El 1983, l'equip de Luc Montagnier de l'Institut Pasteur de França aïllà per primer cop el retrovirus actualment anomenat VIH.